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Dengue: una revisión del diagnóstico de laboratorio en la era de las vacunas

By infectoweb / Publicado el 13 de junio 2024

El pasado 09 de mayo de 2024, en la revista Journal of Medical Microbiology, se publicó el artículo de Jaimie L. Frazer y colaboradores, titulado “Dengue: A review of laboratory diagnostics in the vaccine age”. Este articulo parte del hecho de que las pruebas de diagnóstico en dengue (DENV) son importantes por razones de manejo clínico, epidemiología y salud pública, y su objetivo fue el de presentar los métodos de diagnóstico de laboratorio actuales en el contexto de la epidemiología cambiante de la enfermedad y la disponibilidad de vacunas. 

A continuación se destacan los temas abordados más relevantes en el artículo:

Aislamiento viral

El aislamiento viral es la prueba de referencia para la identificación y serotipificación del DENV. Durante la enfermedad, la recolección temprana de muestras aumenta las posibilidades de detección exitosa del virus mediante métodos de aislamiento. En las muestras con una mayor carga viral por RT-PCR y un título más bajo de anticuerpos IgM e IgG se tendrá una mayor probabilidad de aislar exitosamente el virus; debido a esto, es menos probable que el aislamiento viral tenga éxito en la infección secundaria. Se pueden utilizar varias muestras, incluidas suero, plasma, liquido cefalorraquídeo y tejidos derivados de la autopsia. Se debe tener en cuenta que el rendimiento de las muestras depende del manejo preanalítico, lo que afecta la sensibilidad. Se ha observado una disminución significativa en la detección de virus en cultivos a partir de suero con 24h de almacenamiento en refrigerador, o 15 días de congelación a -30°C, en comparación con el procesamiento inmediato a partir del almacenamiento en nitrógeno líquido. 

El aislamiento y el cultivo del virus no se utilizan en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico porque son costosos, laboriosos y requieren mucho tiempo. Además, los métodos de amplificación molecular, detección y secuenciación se pueden realizar directamente en muestras clínicas sin requerir un paso de aislamiento del virus con posterior identificación y titulación. El aislamiento del virus y el cultivo de muestras de diagnóstico se realizan principalmente en laboratorios de referencia donde se requiere la generación de antígeno para pruebas, reactivos y fines de investigación, o para pruebas de neutralización en placa. Por su parte, el cultivo de virus circulantes es importante para fines de laboratorio de referencia y de salud pública, incluido el apoyo al desarrollo de futuras pruebas de diagnóstico, vacunas y reactivos. 

Ensayo de neutralización

El ensayo de neutralización es la prueba de referencia utilizada en la evaluación de anticuerpos asociados a inmunidad o a la respuesta a la vacuna, aunque la presencia de anticuerpos neutralizantes puede no coincidir completamente con la protección contra la infección. El ensayo de neutralización es la prueba serológica más específica para la infección primaria, con respecto a la neutralización cruzada con otros flavivirus, pero para una infección posterior por flavivirus o reinfección por dengue, los títulos tienden a estar sesgados hacia el serotipo infectante original; esto reduce la especificidad de la prueba en infecciones secundarias u otra infección por flavivirus. 

Detección del antígeno NS1

La proteína no estructural 1 (NS1) es una glicoproteína viral altamente conservada que puede usarse en pruebas serológicas y de diagnóstico rápido. Es detectable en la infección primaria (generalmente entre los días 1 y 9 de los síntomas, aunque se ha registrado hasta el día 18, y puede exceder la duración de la viremia. En la infección secundaria, NS1 es paradójicamente detectable en concentraciones más altas, sin embargo, tiene una duración más corta (5 a 7 días) respecto a la infección primaria, debido, posiblemente, a una respuesta inmune anamnésica que resulta en la formación de complejos inmunes con IgM e IgG. 

La detección del antígeno NS1 está disponible en pruebas comerciales mediante ELISA y en pruebas inmunocromatográficas (pruebas rápidas). La sensibilidad es del 94% en relación con el cultivo viral. En relación con la PCR, la sensibilidad es del 87% al 88% para la ELISA y del 81% para las pruebas rápidas. La sensibilidad es mayor en pacientes sin IgM e IgG positivas en el momento de la prueba. Las estudios han confirmado una alta especificidad (superior al 97%) en regiones donde están presentes otros arbovírus y enfermedades febriles como la leptospirosis y fiebre tifoidea [70]. 

Muestras para diagnóstico molecular

Para el diagnóstico molecular (amplificación de material genético) se utiliza con mayor frecuencia plasma o suero, aunque la detección puede ser posible durante varias semanas más en sangre total. La orina es menos sensible que el plasma en los primeros 5 días de la enfermedad (sensibilidad <50% frente a >90 %). 

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se puede utilizar RT-PCR para detectar el ARN viral. Un estudio de viajeros finlandeses informó detección de ARN viral en plasma durante una media de 9 días de enfermedad, aunque el 35 % ya no era detectable en el día 7. Esto difiere de los estudios de infección primaria en Vietnam, un área endémica, en los que el tiempo de detección de la viremia fue de 6 o 7 días. Por su parte, en la infección secundaria por DENV, la duración de la viremia detectada por PCR es más corta (5 días). 

Secuenciación

La secuenciación es una herramienta adicional utilizada para mejorar la comprensión de la epidemiología del DENV. Los genotipos se han definido mediante la secuenciación del gen E viral. Se reconocen múltiples genotipos dentro de un serotipo. Con la implementación de las metodologías de alto rendimiento de secuenciación de última generación, se puede apreciar una comprensión más detallada de la adaptación viral y la mutación a través de la variación de secuencia, así como la filogenia relacionada con la epidemiología local mediante la comparación de todo el genoma.

Detección de anticuerpos

La detección de anticuerpos es la modalidad de diagnóstico más común en la infección por DENV. Generalmente se realiza en suero o plasma. El uso en el diagnóstico se ve obstaculizado por el grado de reactividad cruzada entre flavivirus, contra los cuales se dirigen la mayoría de los anticuerpos IgG e IgM utilizados en el diagnóstico. Además de esto, muchos ensayos serológicos no distinguen el serotipo viral. 

Detección de IgM por ELISA

Los anticuerpos IgM en suero generalmente son positivos entre el día 6 y 8 de la enfermedad en la infección primaria, pero pueden detectarse tan pronto como a los 3 días en algunos pacientes. Alcanza su punto máximo a las dos semanas y son detectable hasta por 3 meses. Los niveles de IgM son más bajos en la infección secundaria, disminuyen antes y pueden no ser detectables en absoluto en algunos pacientes, dependiendo del momento de la recolección de la muestra. Los títulos también pueden reducirse si el paciente ha sido infectado previamente con otro flavivirus. 

Detección de IgG por ELISA

La IgG puede detectarse en los días 12 a 15 de la infección primaria. En la infección secundaria, es detectable el día 4 en algunos y el día 7 en la mayoría de los pacientes. A su vez, en la infección secundaria la IgG anamnésica es la respuesta primaria de anticuerpos y está dirigida al serotipo previamente infectante. 

Detección de otros anticuerpos

La IgE se ha explorado como objetivo de diagnóstico debido a su sensibilidad potencialmente aumentada en los primeros 3 días de la infección, cuando es posible que la IgM aún no sea detectable. Un ELISA de captura de IgE logró una sensibilidad del 82% y una especificidad del 77% en comparación con la RT-PCR en una cohorte mixta de infección confirmada por DENV1 y DENV2. No se realizó ningún análisis de eficacia en infección secundaria versus primaria. La IgA también ha sido un objetivo de estudio para el diagnóstico en la infección temprana, ya que su persistencia más corta que la IgM puede ser útil para diagnosticar la reinfección en países donde circulan múltiples serotipos o para confirmar el momento de la infección para el análisis epidemiológico. Dadas las dificultades con el diagnóstico de la infección secundaria, se requiere de una evaluación adicional de los ensayos séricos de IgA para determinar la especificidad a la luz de otros flavivirus circulantes.

Dengue primario vs secundario – interpretación de la serología

Como la infección secundaria con un serotipo diferente aumenta el riesgo de dengue grave, diferenciar una infección primaria de una secundaria es clínicamente importante. Es posible diferenciar la infección primaria y secundaria evaluando la proporción de IgM/IgG en una sola muestra aguda. Es probable que la precisión de las proporciones disminuya después de 30 días de la infección y se deben utilizar enfoques alternativos para muestras menos agudas. En muestras agudas, una proporción de IgM/IgG ≥ 1,2 es compatible con infección primaria y < 1,2 con infección secundaria, con una concordancia >90%. 

Serología en el contexto de una vacunación planificada

La Organización Mundial de la Salud recomienda realizar pruebas de detección de IgG antes de la inmunización con algunas vacunas vivas atenuadas que se sabe que aumentan el riesgo de severidad y hospitalización. En entornos de alta transmisión, las pruebas de diagnóstico rápido podrían ser aceptables a pesar de una menor sensibilidad y especificidad. La detección de NS1 puede ser útil para discriminar a los pacientes que nunca han estado expuestos al DENV y excluirlos de la vacunación, y presenta una interferencia mínima de otros flavivirus.

Diferenciar infección de vacunación

La serología puede volverse menos informativa para el diagnóstico agudo a medida que se implementa la vacunación, ya que las vacunas disponibles comercialmente expresan la proteína E viral. La mayoría de las pruebas de anticuerpos actuales miden los anticuerpos contra este epítopo. Por lo tanto, la vacunación puede reducir la especificidad de la IgM e IgG como marcadores de diagnóstico de la infección, probablemente debido a la presencia de anticuerpos inducidos por la vacuna. El anticuerpo contra NS1, que la vacuna no expresa, se ha evaluado en muestras antes y después de la vacunación. La vacunación no provocó seroconversión, pero los anticuerpos NS1 fueron detectables en pacientes con antecedentes de infección previa. La confirmación de la infección con el antígeno NS1, pruebas moleculares, o la serología pareada de IgM e IgG mediante un método cuantitativo, podría ser relevante para confirmar el diagnóstico en la era de la vacunación. 

Pruebas de diagnóstico rápido

Las pruebas de diagnóstico rápido (PDR) se utilizan para el diagnóstico del dengue agudo en el lugar de atención al paciente o en laboratorios más pequeños que no tienen la capacidad de realizar ELISA y pruebas moleculares. La mayoría de las PDR que se utilizan actualmente son inmunocromatográficas en formato de cartucho, ya sea para IgM e IgG, antígeno NS1 o una combinación de estos. El rendimiento general para las pruebas NS1/IgM/IgG logran una sensibilidad combinada del 91% y una especificidad del 96%. 

Algoritmos de diagnóstico en la infección aguda por dengue

La combinación óptima de pruebas de diagnóstico para la infección aguda por DENV depende en gran medida del contexto. Es necesario considerar el historial de vacunación del paciente, el historial de infección por flavivirus, la duración de la enfermedad, la presencia de otros flavivirus en el área geográfica y la disponibilidad de las pruebas. Un componente importante de la interpretación de las pruebas es la probabilidad de infección previa a la prueba, y ésta será mayor en áreas endémicas o hiperendémicas que en áreas no endémicas. La probabilidad de infección previa a la prueba y cualquier historial de infección previa ayudarán a elegir una combinación adecuada de pruebas. 

En un entorno con buenos recursos, en una infección aguda primaria, la detección del antígeno NS1, en combinación con IgM e IgG, es un punto de partida razonable siempre que exista una alta confianza de que el DENV es el único flavivirus al que el paciente puede haber estado expuesto. Se reconoce que en entornos o pacientes con exposición previa a flavivirus, la especificidad se reducirá. Sin embargo, en la enfermedad febril temprana, es probable que una combinación de detección del antígeno NS1, IgM e IgG detecte la mayoría de las infecciones, ya sean primarias o secundarias. Se puede utilizar una relación IgM/IgG para evaluar la probabilidad de infección primaria o secundaria. El uso de IgM e IgG tiene la importante ventaja de no depender del período relativamente corto en el que el antígeno NS1 y el ARN del DENV son detectables, particularmente en la infección secundaria. Sin embargo, cuando los recursos lo permitan, el uso del antígeno NS1 o pruebas moleculares será cada vez más importante en pacientes con antecedentes de vacunación. 

Finalmente, el articulo concluye indicando que la variedad de pruebas y tipos de muestras disponibles aumenta la probabilidad de que el diagnóstico molecular esté disponible en una amplia gama de centros de atención al paciente. Sin embargo, la vacunación afectará la aplicabilidad de los métodos serológicos más utilizados.